2002年首个长效化重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）应用于临床以来，该类药物的研究与开发从未停止。聚乙二醇（PEG）化和融合抗体可结晶片段（Fc）蛋白是两种常见的rhG-CSF长效化形式，均能延长药物半衰期，克服短效药物每日注射的不足¹。然而，二者延长半衰期的方法却迥然不同，药物活性也存在一定差异。2017年7月，韩国Bich Hang Do教授团队在Sci Rep上发表了题为Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) fused with Fc Domain produced from E. coli is less effective than Polyethylene Glycol-conjugated G-CSF的文章，揭示了二者在药物活性、血浆循环时间及提升中性粒细胞数量的作用等方面的异同点，证实了PEG-rhG-CSF较Fc融合蛋白-rhG-CSF更具疗效优势²。
一项临床研究，使用大肠杆菌体系制备Fc融合蛋白-rhG-CSF，分析其体内、体外生物活性和循环半衰期，并与rhG-CSF和PEG-rhG-CSF进行对比，旨在评估Fc融合蛋白-rhG-CSF提升中性粒细胞数量的效果。² Fc融合蛋白-rhG-CSF的制备：使用免疫球蛋白1（IgG1）的Fc结构域构建Fc-rhG-CSF重组序列，将重组序列转入大肠杆菌体系中表达后，分离纯化出Fc融合蛋白-rhG-CSF二聚体。
² PEG-rhG-CSF的制备：先通过大肠杆菌体系制备rhG-CSF，然后通过还原烷基化方法将分子量为20 kD的PEG结构缀合至rhG-CSF的N端，并使用阳离子交换柱分离纯化PEG-rhG-CSF。
在四种诱导温度下测量Fc融合蛋白-rhG-CSF的表达和溶解情况，结果显示，30°C孵育5小时的表达效力和溶解效率最高，分别约为26.7%和74.5%，见图1。图1. 不同温度条件下孵育5小时后Fc融合蛋白-rhG-CSF的表达情况注：此时Fc融合蛋白-rhG-CSF指含有标记基因表达，未分离和纯化的蛋白，箭头表示目标蛋白；M：分子量标记；C：诱导细胞表达Fc融合蛋白-rhG-CSF前的细胞总蛋白表达情况（阴性对照）；T：诱导后细胞总蛋白表达情况；P：细胞匀浆状态下不可溶性部分；S：细胞匀浆状态下可溶性部分蛋白A树脂在235-270 mL保留体积中可将约90%的多聚体分离，纯化Fc融合蛋白-rhG-CSF二聚体。凝胶过滤柱可分离不同分子量的蛋白质，纯化出不含标记基因表达的最终Fc融合蛋白-rhG-CSF产物。使用蛋白A树脂和凝胶过滤柱对Fc融合蛋白-rhG-CSF进行分离和纯化，可从1 L大肠杆菌细胞中获得约1 mg的Fc融合蛋白-rhG-CSF。见图2。
图2. 分离Fc融合蛋白-rhG-CSF二聚体和多聚体后凝胶色谱图及不同纯化步骤下的蛋白凝胶电泳图
通过还原烷基化方法将20 kD线型PEG与rhG-CSF连接，并通过阳离子交换柱将PEG-rhG-CSF分离纯化，可从20 mg rhG-CSF中获得8 mg PEG-rhG-CSF。凝胶电泳图显示一个PEG分子与一个rhG-CSF结合，见图3。
图3. rhG-CSF和PEG-rhG-CSF的蛋白凝胶电泳图
将rhG-CSF作为对照，采用纯化后PEG-rhG-CSF和Fc融合蛋白-rhG-CSF测定其体外生物活性。对比发现，三者均遵循S形剂量反应曲线，且EC₅₀值相似，PEG-rhG-CSF较Fc融合蛋白-rhG-CSFEC₅₀更低，表明其活性略强。见图4。
图4. rhG-CSF、PEG-rhG-CSF和Fc融合蛋白-rhG-CSF的剂量反应曲线及EC₅₀值EC₅₀：半效应浓度，代表产生最大效应一半时的药物浓度，数值越小，生物学活性越强通过动物试验评估三种药物的体内生物活性，结果发现，环磷酰胺导致中性粒细胞减少后，三种药物均能有效提升中性粒细胞数量，且PEG-rhG-CSF给药后中性粒细胞恢复速度更快，恢复效果更好。与PEG-rhG-CSF相比，Fc融合蛋白-rhG-CSF的体内活性在第7天开始减弱。见图5。
图5. 单次注射rhG-CSF、PEG-rhG-CSF和Fc融合蛋白-rhG-CSF后中性粒细胞数量变化情况CPA，环磷酰胺；PBS：缓冲液，做阴性对照；第0天注射CPA，第1天注射G-CSF，数据取平均值
通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定三种药物的血浆浓度，注射后24小时，rhG-CSF被完全清除；Fc融合蛋白-rhG-CSF需要48小时以上；PEG-rhG-CSF需要72小时以上。与rhG-CSF相比，PEG-rhG-CSF和Fc融合蛋白-rhG-CSF均能延长血浆持续时间，增加rhG-CSF循环水平。
图6. 单次注射rhG-CSF、PEG-rhG-CSF和Fc融合蛋白-rhG-CSF后药物血浆浓度变化情况
大肠杆菌体系中制备Fc融合蛋白-rhG-CSF具有可行性，其体外生物活性较PEG-rhG-CSF略低。肿瘤治疗导致中性粒细胞减少后，PEG-rhG-CSF和Fc融合蛋白-rhG-CSF均能提升粒细胞数量，且PEG-rhG-CSF给药后粒细胞恢复速度更快，恢复效果更好，清除速率更慢，血浆持续时间更长。
PEG技术通过产生亲水性保护和降低肾脏清除率，延长药物在体内作用时间。融合Fc蛋白是利用Fc与FcRn相互作用保护药物免受溶酶体破坏，进而延长药物血浆持续时间。两种方法殊途同归，均能延长rhG-CSF的半衰期。
本研究在多个方面将PEG-rhG-CSF和Fc融合蛋白-rhG-CSF进行对比，直观地表明两种长效制剂中，PEG-rhG-CSF用于中性粒细胞提升的优越性。最新一代PEG-rhG-CSF——拓培非格司亭采用更优化的40 kD支链PEG结构，与本研究中所用的传统PEG-rhG-CSF相比，半衰期更长，有效改善其他同类产品因PEG分子量不够、给药剂量过高导致的骨髓过度刺激，在减少骨痛等不良反应的发生风险方面具有明显优势，为恶性肿瘤患者提供了更高效、更安全的新兴之选。
1.Theyab A, et al. Front Oncol. 2023;12:1026377.2.Do BH, et al. Sci Rep. 2017;7(1):6480. 
