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从”长“计划 | 浅谈PEG化修饰技术在长效G-CSF开发中的作用

歆语健康发布于 2023-09-22 18:00

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导语

化疗导致的中性粒细胞减少（CIN）与许多并发症相关，如粒细胞减少性发热（FN）、败血症等，增加了患者死亡的风险¹⁻²。重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）能够有效预防和治疗CIN及FN，但rhG-CSF半衰期短，需每日皮下注射。而聚乙二醇（PEG）与rhG-CSF结合形成的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子（PEG-rhG-CSF）对rhG-CSF进行结构的优化，具有注射次数少、注射剂量小、患者依从性高等优点，在减少化疗患者注射及门诊就诊次数，降低感染风险等方面具有突破性的价值。

rhG-CSF介绍及其局限性

人粒细胞集落刺激因子（hG-CSF）是一种造血生长因子，由第17号染色体上的CSF3基因编码，包含四个反向平行的左旋α-螺旋折叠束，可调节中性粒细胞增殖、分化和存活（见图1）³。rhG-CSF是通过基因重组技术产生的由175个氨基酸组成的重组蛋白，具有与hG-CSF几乎相同的生物活性及与药理作用⁴。

图1. rhG-CSF的结构及其药理作用

目前，rhG-CSF已成为治疗和预防CIN的常用药物，可降低肿瘤患者FN发生风险，被应用于临床的rhG-CSF主要包括非糖基化rhG-CSF（如非格司亭）、糖基化rhG-CSF（如来格司亭）和rhG-CSF突变基因产物（如那托司亭）等⁵。

然而，rhG-CSF主要通过肾脏清除，半衰期短（约3.5小时），需要每日静脉注射或皮下注射，导致患者注射部位感染率增加，耐受性、依从性降低。临床实践显示，多数患者rhG-CSF持续治疗时间≤7天，剂量不足导致其临床疗效不佳⁶。此外，rhG-CSF还存在体内稳定性差等问题，容易使患者产生药物耐受性及免疫排斥等不良反应。因此非常有必要开发长效化rhG-CSF来提高其临床药效。

rhG-CSF的PEG修饰

目前，开发长效化rhG-CSF的技术包括化学修饰（如PEG修饰等）、融合蛋白以及新剂型等（见图2）。

图2. 长效化rhG-CSF的开发策略

Fc，可结晶片段；rhIgG-Fc，重组人免疫球蛋白的可结晶片段；rHSA，重组人血清白蛋白

PEG是一种无毒、无刺激性、无免疫原性的聚合物。PEG修饰是应用最广泛且最成功的化学修饰技术，可通过增加蛋白的水合程度，增大PEG化蛋白的体积；同时还可通过PEG的屏障作用来保护蛋白不易被蛋白酶水解并减少其抗原性和免疫原性，从而稳定蛋白在体内的活性，延长其在体内循环时间⁵,⁷。

PEG-rhG-CSF由PEG和rhG-CSF共价结合形成，是对rhG-CSF的化学修饰和优化，是rhG-CSF的长效化制剂。PEG修饰可增加药物分子量，从而降低肾脏清除率，使中性粒细胞介导的清除成为其主要清除机制，中性粒细胞较少时清除速度较慢，有利于中性粒细胞的生成；中性粒细胞较多时清除速度较快，可避免中性粒细胞数量过多⁸。

PEG-rhG-CSF克服了rhG-CSF半衰期短、需每日注射的缺点，每个化疗周期给药一次，在临床应用中可避免多次注射的痛苦和多次住院的费用，提高患者依从性²。在疗效方面，PEG-rhG-CSF可进一步改善rhG-CSF的升白作用，降低CIN、FN发生风险。最新荟萃分析表明，与rhG-CSF比较，多种PEG-rhG-CSF可显著缩短恶性肿瘤患者严重CIN持续时间，降低FN发生率（见图3）⁹。

图3. 多种长效化rhG-CSF与rhG-CSF相比的严重CIN持续时间及FN发生率

条形代表95%置信区间；红色方块代表P＜0.05；蓝色方块代表P＞0.05

Fc融合蛋白-rhG-CSF是另一种rhG-CSF的长效化制剂，通过融合Fc蛋白维持IgG循环延长半衰期。与Fc融合蛋白-rhG-CSF比较，①PEG-rhG-CSF的体外生物学活性（EC₅₀）更高，②提升中性粒细胞的效果更好，③体内作用时间更长（见图4）¹⁰。

图4. PEG-rhG-CSF和Fc融合蛋白-rhG-CSF的活性和体内作用时间对比

通过检测小鼠骨髓性白血病M-NFS-60细胞系的增殖反映PEG-rhG-CSF和Fc融合蛋白-rhG-CSF的体外生物活性

通过观察CIN大鼠模型的中性粒细胞恢复情况，评估PEG-rhG-CSF和Fc融合蛋白-rhG-CSF（第1天注射）提升中性粒细胞计数的效果

EC₅₀'半效应浓度，代表产生最大效应一半时的药物浓度，EC₅₀值越小，生物学活性越强；CPA，环磷酰胺100 mg/kg（第0天注射）

值得注意的是，PEG-rhG-CSF的预防性使用一旦开始，建议在整个化疗阶段中持续进行，以降低CIN发生风险²，保证患者化疗的正常进行。

不同PEG结构的差异性

目前，我国临床应用的PEG-rhG-CSF包括PEG-rhG-CSF注射液、硫培非格司亭和拓培非格司亭，均采用直链或支链结构PEG分子修饰rhG-CSF（见图5），具有相似的理化性质、功能特性和安全性¹¹⁻¹⁵。

图5. 我国临床应用的PEG-rhG-CSF及其PEG修饰结构

然而，不同的PEG结构类型和分子量之间存在明显差异。以拓培非格司亭为例，其PEG分子采用具有分支的40 kD支链结构，可增加耦联的PEG分子量和环氧乙烷单元（CH₂CH₂O）的数量，进一步增强PEG对rhG-CSF的屏蔽作用，延长药物半衰期⁷,¹⁶。

多项体外试验通过皮下注射PEG-rhG-CSF后中性粒细胞数量增加情况，评估PEG分子量与PEG-rhG-CSF体内生物活性的关系。研究结果均显示：PEG分子量与PEG-rhG-CSF的体内生物活性呈正相关（见图6）¹⁶,¹⁷。证实了不同PEG分子修饰rhG-CSF后形成的PEG-rhG-CSF提升中性粒细胞数量的水平也不相同。

图6. PEG分子量与PEG-rhG-CSF体内生物活性的关系（药物体内活性表现为中性粒细胞计数增加）

拓培非格司亭采用的PEG结构分子量更大，提升中性粒细胞数量的作用更强，使用剂量更低，仅为其他PEG-rhG-CSF剂量的三分之一（见图5）。一项剂量探索研究显示，PEG-rhG-CSF的剂量与患者骨痛发生率密切相关，剂量越大，骨痛发生率越高¹⁸。基于此，拓培非格司亭骨痛风险更小，安全性更好。

图7. PEG-rhG-CSF使用剂量与骨痛发生率的关系

现有PEG-rhG-CSF中，仅有拓培非格司亭采用的是40 kD支链PEG修饰结构，因此拓培非格司亭的分子量、流体动力学半径及流动性较其他PEG-rhG-CSF更大，清除速率更慢，半衰期更长，剂量更低，安全性更好。

PEG-rhG-CSF是对rhG-CSF的优化，克服了rhG-CSF半衰期短、需每日注射的缺点，临床应用时可提高患者依从性及临床疗效。采用新型支链PEG修饰的拓培非格司亭具有更大分子量，更长半衰期和更好的安全性，相对传统PEG-rhG-CSF具有更大的临床优势和前景。其目前已在我国上市，随着药物的进一步推广应用，必将惠及更多恶性肿瘤患者。

参考文献：

[1] 肿瘤化疗导致的中性粒细胞减少诊治中国专家共识（2023版）

[2] 周建红,等. 医学综述,2021,27(15):3067-3072.

[3] Theyab A, et al. Hematology. 2021;26(1):628-636.

[4] Rosales C. J Leukoc Biol. 2020;108(1):377-396.

[5] 王旭东,等.药学学报,2022,57(04):875-883.

[6] Cornes P, et al. Adv Ther. 2018;35(11):1816-1829.

[7] 戴莉莉,等.现代生物医学进展,2007,7(4):603-606,610.

[8] Theyab A, et al. Front Oncol. 2023;12:1026377.

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[10] Do BH, et al. Sci Rep. 2017;7(1):6480.

[11] 津优力^®说明书