从结构到疗效——GD2单抗的亲和力如何影响抗神经母细胞瘤功效
2013年，《科学》杂志将肿瘤免疫疗法誉为“年度突破”，这一疗法凭借其颠覆性的治疗理念和显著的临床效果，为肿瘤治疗领域带来了前所未有的变革。在神经母细胞瘤这一特定领域，GD2单抗作为唯一获得官方批准的单克隆抗体，更是以其独特的靶向性和免疫激活能力，成为了治疗领域的关键突破。GD2单抗的构造特性决定了其与肿瘤细胞的结合亲合力，这一特性是决定其对抗神经母细胞瘤效果的关键因素。然而，亲和力与抗肿瘤效能之间的关系远非直线性的简单增强。本文旨在通过分析目前获批准的三种GD2单抗实例，深入探讨具有不同亲和力的GD2单抗发挥抗肿瘤效应的差异。GD2单抗是一种异四聚体蛋白，由重链和轻链两条相同的肽链对组成。重链和轻链均由可变区（V）和恒定区（C）组成，见图1。
Fab：抗原结合片段；Fc：可结晶片段；CDR：互补决定区；VL，轻链可变区；VH，重链可变区；CL，轻链恒定区；CH，重链恒定区
GD2单抗由抗原结合区（Fab）和可结晶区（Fc）两大核心部分组成，前者专门识别并结合神经母细胞瘤细胞表面的GD2抗原，而后者则与免疫细胞上的Fc受体等结构发生相互作用。在Fab区域内，重链的可变区（VH）与轻链的可变区（VL）均含有三个高度变异、由特定氨基酸序列构成的区域，这些区域被称作互补决定区（CDR），具体分为CDR1、CDR2和CDR3。CDR区域扮演着识别并特异性结合抗原的关键角色，其结构特征直接关联到GD2单抗与靶抗原结合的亲和力强弱。转向Fc区域，其重链的恒定区（CH2）中包含一个位于天冬酰胺（Asn）-297位置上的N-连接糖基化位点。这一糖基化修饰是GD2单抗Fc部分的重要结构特征，其基本构成包括一个七糖核心，以及在此基础上进一步修饰的岩藻糖和α-半乳糖苷酶等附加结构。值得注意的是，Fc区域去岩藻糖化的程度与抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）的效力紧密相关，而α-半乳糖苷酶的存在则与抗体的免疫原性有关，可能诱发机体的过敏反应。
糖基化修饰构成了GD2单抗Fc片段的核心架构，其中岩藻糖作为一种关键的单糖成分参与其中。岩藻糖的添加（即岩藻糖基化）会导致GD2单抗与Fc受体之间产生空间位阻，从而降低Fc段与自然杀伤（NK）细胞上负责引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）的Fc受体的结合亲合力，进而影响ADCC的效果。相应地，去除岩藻糖基化（即去岩藻糖基化）能够减轻这种空间排斥，促进抗体与Fc受体之间形成更加紧密的结合，构建出更为稳定的复合物结构，从而显著增强ADCC的效能。此外，这一过程还能同时提升单核细胞与巨噬细胞介导的抗体依赖细胞吞噬作用（ADCP）的效率。这一机制如图2所示。图2. 去岩藻糖基化结构增强GD2单抗Fc段与Fc受体结合的亲和力
灰色部分为抗体的Fc段；浅橙色部分为免疫细胞表面的FcγⅢa（即 Fc段的受体）；
中间方框部分浅红色和浅绿色的球状部分是Fc受体的聚糖结构，该结构与Fc受体的连接点位于ASN-162（黄色小球）；
棒状部分为抗体Fc段的聚糖结构，该结构与抗体Fc段的链接点位于ASN-297（黑色小球）；其中红色棒状部分即为岩藻糖基化结构，该结构的存在使得Fc受体与抗体Fc段之间发生冲突
达妥昔单抗的去岩藻糖基化比例为0.7%，达妥昔单抗β达到6.6%。二者相比，达妥昔单抗β去岩藻糖基化比例更高，所以ADCC效力是达妥昔单抗的5-10倍。见图3。
图3. 达妥昔单抗β与达妥昔单抗的ADCC效力与CDC效力对比ADCC，抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用；CDC，补体介导的细胞毒性GD2单抗的抗肿瘤效果受其糖基化结构的差异影响显著，这一结构直接决定了抗体与Fc受体结合的亲和力强弱。具体而言，与达妥昔单抗相较，达妥昔单抗β通过优化其糖基化模式，实现了与Fc受体结合亲和力的提升，进而使其ADCC效力增强了5至10倍之多，而在补体依赖的细胞毒性（CDC）效力方面则表现相当。互补决定区（CDR）作为GD2单抗结构中的核心组成部分，对其特异性识别及与靶标的亲和力起着决定性作用。当前，我国已批准上市的GD2单抗包括达妥昔单抗β（商品名：ch14.18/CHO）与那西妥单抗（商品名：hu3F8）。通过对这两种单抗的CDR区域进行深入结构比对，发现它们之间存在显著差异，相似度仅为23%，如图5所示。
图5. 达妥昔单抗β与那西妥单抗的CDR三维结构及区别这种CDR三维结构上的差异赋予了那西妥单抗对肿瘤表面GD2抗原约10倍于达妥昔单抗β的高亲和力，其主要归因于那西妥单抗具有更低的解离率。然而，值得注意的是，抗体的亲和力并非直接等同于其抗肿瘤细胞毒性效应的强度。然而，值得注意的是，抗体的亲和力并非直接等同于其抗肿瘤细胞毒性效应的强度。当抗体的亲和力过高时，可能会以二价形式紧密结合靶抗原，即两个Fab段同时与抗原结合，这反而可能导致部分抗体的Fc段无法有效参与触发抗肿瘤免疫反应，从而影响整体的抗肿瘤效果。相反，具有中等亲和力的抗体更倾向于以单价形式与靶抗原结合，这种结合模式能够最大化抗体的利用效率，从而更有效地激活抗肿瘤效应，达到理想的治疗效果，如图6所示。
图6. 抗体与靶抗原结合的亲和力与效应功能调节的模型图这一特性在三种GD2单抗中具有明显体现，尽管那西妥单抗的亲和力是达妥昔单抗β的10倍，却并未增强其肿瘤杀伤效力。与那西妥单抗相比，中等亲和力的达妥昔单抗β抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）效力增强了20%。此外，那西妥单抗的ADCP效力与达妥昔单抗相当。三个GD2单抗的CDC效力相当。见图7。
综上所述，我们可以看出，由于三个GD2单抗糖基化结构和CDR结构的不同，决定了三个产品的肿瘤杀伤效力不同：达妥昔单抗β的ADCC效力是达妥昔单抗的5-10倍，ADCP效力相较那西妥单抗提高了20%，达妥昔单抗和那西妥单抗的ADCC和ADCP效力相当。三个产品的CDC效力相当。见图8。
图8. 达妥昔单抗β的ADCC、ADCP效力优于达妥昔单抗与那西妥单抗
另外，达妥昔单抗β不含α-半乳糖甘酶，相对于达妥昔单抗，其过敏风险更低，对于神经母细胞瘤患者更安全，见图9。图9. 达妥昔单抗β与达妥昔单抗的α-半乳糖甘酶比例及过敏风险NB，神经母细胞瘤；EMA报道为过敏、荨麻疹、过敏性休克、瘙痒、水肿、皮疹和支气管痉挛D2单抗作为神经母细胞瘤治疗领域内最为成熟的免疫疗法之一，其机制在于直接靶向并结合GD2抗原，形成抗原-抗体复合物，进而触发抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）、抗体依赖细胞吞噬作用（ADCP）以及补体依赖的细胞毒性作用（CDC）等多重免疫效应，以实现对神经母细胞瘤细胞的有效杀伤。在中国，达妥昔单抗β标志着首个针对神经母细胞瘤的GD2单抗疗法的诞生，于2021年获得批准，用于治疗初治高危及复发/难治性神经母细胞瘤患者，特别是那些伴有骨/骨髓转移的情况。随后在2022年，那西妥单抗也获批上市，专门用于治疗仅限于伴有骨/骨髓转移的复发或难治性神经母细胞瘤。本文深入探讨了GD2单抗的CDR区域和糖基化结构对其亲和力的影响，并从结构药理学的独特视角出发，分析了亲和力差异如何进一步影响抗体的抗肿瘤功效。研究发现，GD2单抗与抗原的结合亲和力并非简单地“越高越好”，而是存在一个最优范围。当亲和力过高时，反而可能导致抗肿瘤效果减弱，这一反常现象提示我们，在临床治疗决策中，不能单一依赖亲和力指标。因此，在选择具体的免疫治疗药物时，应综合考虑GD2单抗的疗效、安全性以及患者的具体情况，做出更为全面和科学的决策。参考文献：
1.Voeller J, et al. J Pediatr Hematol Oncol. 2019;41(3):163-169.
2. https://www.rapidnovor.com/identifying-cdrs-antibody-sequencing/3. Van Holsbeeck K, et al. Bioorg Chem. 2022;119:105563.4. Abstracts from the 52th Congress of the International Society of Paediatric Oncology (SIOP) Virtual Congress, October 14-17, 2020. Pediatr Blood Cancer. 2020;67 Suppl 4:e28742.6. Lisby S, et al. International Society of Paediatric Oncology (SIOP) 2020 Virtual Congress. October 14-17, 2020. Abstract #945.7. Mazor Y, et al. PLoS One. 2016;11(6):e0157788.8. Park JA,et al. J Clin Oncol. 2020 Jun 1;38(16):1836-1848.9. Loibner H, et al. Presented at: Int Soc Paediatr Oncol Eur Neuroblastoma 2014; Vienna, Austria.10.Loibner H, et al. Presented at: International Society of Paediatric Oncology Europe Neuroblastoma. 2014. Vienna, Austria; 作者：歆语健康
